PRÁCTICA 4 RECUENTO DE BACTERIAS EN PLACA SEGÚN NOM-092-SSA1-1994 (Mediante Diluciones Seriadas de acuerdo a NOM-110-SSA1-1994)
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Catedrático:
Dra. Dinora Marina León Gutierrez
Integrantes:
Zaudi Salmai Chavez Carvajal
Katherine Cardenas Beristain
Oudry Yamileth Rosado Balderas
Marion Alejandra Quiroz Maldonado
Jorge de Jesús Quinto Reyes
Erick Antonio Martinez Rodriguez
1.Objetivos
Que el alumno aprenda el procedimiento para la esterilización
de material para análisis microbiológico, la elaboración de medios de cultivo,
la preparación de diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios
y estime la cantidad de microorganismos viables presentes en
un alimento, agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un
medio sólido, incubado aeróbicamente.
2.Fundamento
La esterilización es un método de
eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de
cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación
incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren
buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.
La esterilización por calor seco
o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio
de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación,
por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a
150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de
asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo
afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para
esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y
cultivos bacterianos que se desechan.
El equipo de uso común es la
autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in^2); con esta presión
el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15
minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras
bacterianas más resistentes al calor.
Como en los estudios de
microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y
materiales de naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de
cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán
de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la
Tabla 2.
Tabla 2. Métodos de esterilización.
Dependiendo de la cantidad de microorganismos esperados en una muestra,
se requerirá realizar diluciones para el examen microbiológico de alimentos. La
dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme
posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el
análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias,
tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen,
para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso
de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dilución
primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o
medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de
nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las
suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la
dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por
repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la
serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de
cultivo.
Cuando se requiere investigar el contenido de
microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la
cuenta en placa. Esta técnica no pretende poner en evidencia todos los
microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por
sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan
una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo
sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y
psicotróficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo
diferentes condiciones de almacenamiento. El fundamento de la técnica consiste
en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de
un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia
proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. Unidades Formadoras
de Colonias (UFC), es el término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de
células.
Los estudiantes llevarán su muestra, marcador
permanente para rotular el material, tijeras para cortar papel, papel aluminio
para pesar el medio de cultivo, encendedor para prender el mechero, clip
metálico para meter el algodón a las pipetas, servitoallas detergente líquido,
vestimenta adecuada para trabajo en laboratorio (Bata cerrada, pantalón blanco
largo, zapato cerrado, guantes estériles, cubrebocas, gafas o careta, cofia,
cabello recogido, sin accesorios, uñas recortadas), libreta de bitácora, gadget
para tomar fotos.
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado
analítico.
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH
cercano a la neutralidad
Preparación de reactivos
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
INGREDIENTES CANTIDADES
Hidróxido
de sodio 4,0 g
Agua
100,0 ml
Preparación:
- Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
- Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).
INGREDIENTES
CANTIDADES
- Fosfato de sodio monobásico 34,0 g
- Agua 1,0 l
Preparación:
- Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
- Llevar a un litro con agua.
- Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
- Conservar en refrigeración (solución concentrada).
- Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
- Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
- Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
- Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
INGREDIENTES CANTIDADES
- Peptona 1,0 g
- Cloruro de sodio 8,5 g
- Agua 1,0 l
Preparación:
- Disolver los componentes en un litro de agua.
- Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
- Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
- Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
- Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
- Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
Medio de Cultivo.
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).
INGREDIENTES CANTIDADES
- Extracto de levadura 2,5 g
- Triptona 5,0 g
- Dextrosa 1,0 g
- Agar 15,0 g
- Agua 1,0 l
Preparación del medio de cultivo.
Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de
agua. Hervir hasta total disolución. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no
mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo.
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final del
medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC
± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso.
El medio no debe de fundirse más de una vez.
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del
fabricante.
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para
algunos alimentos en particular se requerirá de un medio de cultivo especial
que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.
Materiales
- Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml
- Probeta de 50 ml
- Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
- Cilindros de acero inoxidable para esterilizar pipetas
- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
- Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
- Gradilla
- Cajas de Petri de vidrio
- Cilindros de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri
- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
- Algodón, gasa, papel estrasa,
- Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:
- Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o
- Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
- El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
Aparatos e instrumentos
- Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
- Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
- Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
- Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
- Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
- Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
- Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.
- Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
- Registrador mecánico o electrónico.
- Microscopio óptico.
4. Procedimiento
Esterilización del area de trabajo:
·
Esterilización
con alcohol y servitoalla. Preparación de matraces y pipetas:
· Envolvimiento de pipetas, creación de
capuchas de matraces con la disolución y medio de cultivo, y rotulación de
cajas petri.
th Preparar material e instrumentos para el horno y autoclave:
·
Introducir la lata contenedora de cajas Petri, los
matraces con las disoluciones y el medio de cultivo.
Aseguramiento del autoclave y monitoreo de la presión:
·
Horno,
durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o
·
Autoclave,
durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
· El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
Encendido del mechero Bunsen:
Preparación de la dilución primaria.
Para
la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada
suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa
de grasas animales y vegetales).
Agitar
la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9
ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
Transferir
1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9
(10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente
estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente.
La
selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a
inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con
base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga
del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de
información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
Utilizar
pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que
se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10%
de la capacidad total de la pipeta.
Si la pipeta es terminal y se
transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir
aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin
líquido.
Mientras se afora el líquido de la
pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y
mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo
necesario.
En estudios donde se busca la presencia
o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no
es necesario preparar diluciones mayores.
El criterio para seleccionar las
diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:
Para la técnica del número más probable
utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de
la dilución más alta.
Para la técnica de cuenta en placa,
considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un
mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias
en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número
especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.
Duración del procedimiento.
En general, las diluciones de la
muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben
ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos
posteriores a su preparación.
Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas
según la NOM-110-SSA1-1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos
para su Análisis Microbiológico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del
medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en
el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta
de las cajas. Dejar solidificar.
Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y
diluyente preparado como testigo de esterilidad.
Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por
el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y
microorganismo de que se trate, véase el cuadro 1.
CUADRO 1
|
Grupo Bacteriano |
Temperatura |
Tiempo de Incubación
|
|
Termofílicos aerobios |
55 ± 2ºC |
48 ± 2 h |
|
Mesofílicos aerobios* |
35 ± 2ºC |
48 ± 2 h |
|
Psicrotróficos |
20 ± 2ºC |
3 - 5 días |
|
Psicrofílicos |
5 ± 2ºC |
7 - 10 días |
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta.
Contar todas las colonias desarrolladas en las placas
seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias
puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se
pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.
5. Expresión de resultados
Se realizó 8 cultivos, de los cuales se seleccionara 2, para el conteo de Unidades formadoras de colonias (UFC).
En la primer placa 10-2 el conteo de colonias resultó en 127
colonias las cuales se multiplicaron x 4= 508 colonias. En la placa 10-2b se
contaron 87 x 4= 348. Se promediaron
ambos resultados, 508+348 /2 = 428x10-2 UFC o 42 800 UFC/10 mL -> ml que se
tomaron de la muestra.
MORFOLOGÍA:
Colonias con aspecto puntiformes con presuntos hongos de color blanco,
dispersas y algodonosas. No se puede apreciar la elevación pero el borde es regular.
6. OBSERVACIONES, DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Observaciones:
1. Se tomó en cuenta solo las placas con UFC no mayor
a 250, ya que después de esta, iban a ser incontables.
Debido a la contaminación de una de las pipetas que entro en contacto con el personal, la muestra 10- se encontró una mayor cantidad de microorganismos
1. 3. La muestra del alimento, no fue vaciado
directamente del envase original, este se vertió a un termo no esterilizado, lo
cual pudo influir en la experimentación.
Discusión:
·
Para realizar los análisis microbiológicos se
utilizaron las metodologías establecidas en las Normas Oficiales Mexicanas,
publicadas en el Diario Oficial de la Federación (NOM-110-SSA1-1994,
NOM092-SSA1-1994, NOM-111-SSA1-1994, NOM-112-SSA1-1994, NOM-115-SSA1-1994,
NOM-114- SSA1-1994, NOM-031-SSA1-1993). Dentro de la clasificación de Zumos,
néctares, bebidas a base de frutas y verduras no pasteurizadas.
·
Siendo el límite máximo permitido de 100,000
UFC.
·
A lo cual según nuestro análisis reporto una cantidad de UFC (44,500) dentro de la norma.
·
De 8 muestras solamente una mostro una
contaminación evidente, debido a un error en la manipulación del procedimiento.
Conclusiones:
·
Se determinó la importancia de la esterilización de
los instrumentos y equipo de trabajo para asegurar un resultado más asequible.
·
Se realizaron diversos métodos científicos de
comprobación, análisis y diferenciales para detectar los microorganismos
formadores de colonias.
·
El 90% de las
muestras, obtuvieron un resultado dentro de la norma, denotando un
manejo adecuado de la inocuidad de los alimentos en la empresa desarrolladora
de la muestra de jugo vegetal.
·
El análisis y la correcta implementación de los
estudios microbiológicos demostraron una influencia importante en el manejo
higiénico de los alimentos.
7. Referencias
Camacho, A. M. (2009). Cuenta en placa de bacterias.
(UNAM, Editor) Recuperado el 28 de Abril de 2019, de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf
NORMA OFICIAL MEXICANA
NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS
AEROBIAS EN PLACA. (10 de Noviembre de 1995). Recuperado el 28 de Abril de
2019, de http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html
NORMA Oficial Mexicana
NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de. (10 de Mayo de 1995).
Recuperado el 28 de Abril de 2019, de
http://www.ordenjuridico.gob.mx/Documentos/Federal/wo69533.pdf
Anacleto Félix-Fuentes, Olga Nydia
Campas-Baypoli y Mercedes Meza-Montenegro (2005). CALIDAD SANITARIA DE
ALIMENTOS DISPONIBLES AL PÚBLICO DE CIUDAD OBREGÓN, SONORA, MÉXICO. Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias,
Instituto Tecnológico de Sonora. Consultado [24/04/2022]. Obtenido de: https://respyn.uanl.mx/index.php/respyn/article/view/149
8. ANEXO
Escala
Valorativa para Reporte de Práctica de Laboratorio
|
Criterio de Desempeño |
Valor |
Observaciones |
|
Escudo UV, Nombre de Facultad,
Nombre de EE Nombre de estudiantes por orden alfabético del apellido, Nombre
de académico |
/1 |
|
|
Fundamento, Objetivo,
Metodología, Materiales y Equipo |
/1 |
|
|
Resultados |
/2 |
|
|
Fotos de Metodología y
Resultados con pie de foto |
/1 |
|
|
Observaciones, Discusión y
Conclusión |
/1 |
|
|
Referencias APA |
/1 |
|
|
Ortografía, Redacción y
Justificación de Texto |
/1 |
|
|
Practica Subida a blog y Enlace
de Blog compartido en Eminus |
/1 |
|
|
Puntualidad |
/1 |
|
|
Total |
/10 |
|
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