Práctica 4. Recuento de bacterias en placa según NOM-092-SSA1-1994 (Mediante dilusiones seriadas de a cuerdo a NOM-110-SSA1-1994)

PRÁCTICA 4 RECUENTO DE BACTERIAS EN PLACA SEGÚN NOM-092-SSA1-1994 (Mediante Diluciones Seriadas de acuerdo a NOM-110-SSA1-1994)

Catedrático: 

    Dra. Dinora Marina León Gutierrez

    Integrantes: 

    Zaudi Salmai Chavez Carvajal

     Katherine Cardenas Beristain

     Oudry Yamileth Rosado Balderas

     Marion Alejandra Quiroz Maldonado

     Jorge de Jesús Quinto Reyes

     Erick Antonio Martinez Rodriguez

 

1.Objetivos

Que el alumno aprenda el procedimiento para la esterilización de material para análisis microbiológico, la elaboración de medios de cultivo, la preparación de diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios y estime la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un medio sólido, incubado aeróbicamente.

2.Fundamento

La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.

La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan.

El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in^2); con esta presión el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la Tabla 2.

Tabla 2.  Métodos de esterilización.

Dependiendo de la cantidad de microorganismos esperados en una muestra, se requerirá realizar diluciones para el examen microbiológico de alimentos. La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dilución primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. Unidades Formadoras de Colonias (UFC), es el término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.

3. Reactivos y materiales

Los estudiantes llevarán su muestra, marcador permanente para rotular el material, tijeras para cortar papel, papel aluminio para pesar el medio de cultivo, encendedor para prender el mechero, clip metálico para meter el algodón a las pipetas, servitoallas detergente líquido, vestimenta adecuada para trabajo en laboratorio (Bata cerrada, pantalón blanco largo, zapato cerrado, guantes estériles, cubrebocas, gafas o careta, cofia, cabello recogido, sin accesorios, uñas recortadas), libreta de bitácora, gadget para tomar fotos.

Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.

Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad

 

Preparación de reactivos

 

Solución de hidróxido de sodio 1,0 N

INGREDIENTES CANTIDADES

Hidróxido de sodio 4,0 g

Agua 100,0 ml

Preparación:

1. Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
2. Soluciones diluyentes

 

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).

INGREDIENTES CANTIDADES

• Fosfato de sodio monobásico 34,0 g
• Agua 1,0 l

Preparación:

1. Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
2. Llevar a un litro con agua.
3. Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
4. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
5. Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
6. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
7. Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
8. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

 

Agua peptonada

INGREDIENTES CANTIDADES

• Peptona 1,0 g
• Cloruro de sodio 8,5 g
• Agua 1,0 l

Preparación:

1. Disolver los componentes en un litro de agua.
2. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
3. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
4. Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
5. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
6. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

 

Medio de Cultivo.

Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).

INGREDIENTES CANTIDADES

• Extracto de levadura 2,5 g
• Triptona 5,0 g
• Dextrosa 1,0 g
• Agar 15,0 g
• Agua 1,0 l

Preparación del medio de cultivo.

Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.

Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez.

En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.

El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.

 

Materiales

• Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml
• Probeta de 50 ml
• Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
• Cilindros de acero inoxidable para esterilizar pipetas
• Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
• Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
• Gradilla
• Cajas de Petri de vidrio
• Cilindros de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri
• Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
• Algodón, gasa, papel estrasa,
• Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:
• Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o
• Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
• El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.

Aparatos e instrumentos

• Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
• Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
• Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
• Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
• Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
• Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
• Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.
• Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada  y lente amplificador.
• Registrador mecánico o electrónico.
• Microscopio óptico.

4. Procedimiento

Esterilización del area de trabajo:

·        Esterilización con alcohol y servitoalla. 

Preparación de matraces y pipetas:

·        Colocar torundas de algodón a matraces y pipetas.

Envolver pipetas, capuchas de matraces y rotulación de cajas petri

·      Envolvimiento de pipetas, creación de capuchas de matraces con la disolución y medio de cultivo, y rotulación de cajas petri.

th   Preparar material e instrumentos para el horno y autoclave:

Ingreso de material e instrumentación al autoclave:

·       Introducir la lata contenedora de cajas Petri, los matraces con las disoluciones y el medio de cultivo. 

     Aseguramiento del autoclave y monitoreo de la presión:

Todo el material e instrumentos que tuvo contacto con las muestras bajo estudio se esterilizo mediante:

·       Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o

·       Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.

·       El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.

Encendido del mechero Bunsen:

Preparación de la dilución primaria.

Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente.

La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

 

Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.

Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:

Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilución más alta.

Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente.

Duración del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.

Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según la NOM-110-SSA1-1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.

Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el cuadro 1.

CUADRO 1

Grupo Bacteriano	Temperatura	Tiempo de Incubación
Termofílicos aerobios	55 ± 2ºC	48 ± 2 h
Mesofílicos aerobios*	35 ± 2ºC	48 ± 2 h
Psicrotróficos	20 ± 2ºC	3 - 5 días
Psicrofílicos	5 ± 2ºC	7 - 10 días

 En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta.

Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.

5. Expresión de resultados

Se realizó 8 cultivos, de los cuales se seleccionara 2, para el conteo de Unidades formadoras de colonias (UFC).

Se utilizó las placas 10-2 a y b, debido a que el conteo de UFC era más óptimo.

Se utilizó las placas 10-2 y se dividieron en cuadrantes. Y solo se hizo el conteo en los cuadrantes donde hubiera mayor presencia y visibilidad de UFC. 

En la primer placa 10-2 el conteo de colonias resultó en 127 colonias las cuales se multiplicaron x 4= 508 colonias. En la placa 10-2b se contaron  87 x 4= 348. Se promediaron ambos resultados, 508+348 /2 = 428x10-2 UFC o 42 800 UFC/10 mL -> ml que se tomaron de la muestra.  

MORFOLOGÍA: Colonias con aspecto puntiformes con presuntos hongos de color blanco, dispersas y algodonosas. No se puede apreciar la elevación pero el borde es regular.

6. OBSERVACIONES, DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN

Observaciones:

1.      Se tomó en cuenta solo las placas con UFC no mayor a 250, ya que después de esta, iban a ser incontables.

Debido a la contaminación de una de las pipetas que entro en contacto con el personal, la muestra 10- se encontró una mayor cantidad de microorganismos

1.     3. La muestra del alimento, no fue vaciado directamente del envase original, este se vertió a un termo no esterilizado, lo cual pudo influir en la experimentación. 

Discusión:

·        Para realizar los análisis microbiológicos se utilizaron las metodologías establecidas en las Normas Oficiales Mexicanas, publicadas en el Diario Oficial de la Federación (NOM-110-SSA1-1994, NOM092-SSA1-1994, NOM-111-SSA1-1994, NOM-112-SSA1-1994, NOM-115-SSA1-1994, NOM-114- SSA1-1994, NOM-031-SSA1-1993). Dentro de la clasificación de Zumos, néctares, bebidas a base de frutas y verduras no pasteurizadas.

·        Siendo el límite máximo permitido de 100,000 UFC.

·        A lo cual según nuestro análisis  reporto una  cantidad de UFC (44,500) dentro de la norma.

·        De 8 muestras solamente una mostro una contaminación evidente, debido a un error en la manipulación del procedimiento.

Conclusiones:

·        Se determinó la importancia de la esterilización de los instrumentos y equipo de trabajo para asegurar un resultado más asequible.

·        Se realizaron diversos métodos científicos de comprobación, análisis y diferenciales para detectar los microorganismos formadores de colonias.

·        El 90% de las  muestras, obtuvieron un resultado dentro de la norma, denotando un manejo adecuado de la inocuidad de los alimentos en la empresa desarrolladora de la muestra de jugo vegetal.

·        El análisis y la correcta implementación de los estudios microbiológicos demostraron una influencia importante en el manejo higiénico de los alimentos.

 

7. Referencias

Camacho, A. M. (2009). Cuenta en placa de bacterias. (UNAM, Editor) Recuperado el 28 de Abril de 2019, de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA. (10 de Noviembre de 1995). Recuperado el 28 de Abril de 2019, de http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html

NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de. (10 de Mayo de 1995). Recuperado el 28 de Abril de 2019, de http://www.ordenjuridico.gob.mx/Documentos/Federal/wo69533.pdf

Anacleto Félix-Fuentes, Olga Nydia Campas-Baypoli y Mercedes Meza-Montenegro (2005). CALIDAD SANITARIA DE ALIMENTOS DISPONIBLES AL PÚBLICO DE CIUDAD OBREGÓN, SONORA, MÉXICO.  Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias, Instituto Tecnológico de Sonora. Consultado [24/04/2022]. Obtenido de: https://respyn.uanl.mx/index.php/respyn/article/view/149

8. ANEXO

Escala Valorativa para Reporte de Práctica de Laboratorio

 

Criterio de Desempeño	Valor	Observaciones
Escudo UV, Nombre de Facultad, Nombre de EE Nombre de estudiantes por orden alfabético del apellido, Nombre de académico	/1
Fundamento, Objetivo, Metodología, Materiales y Equipo	/1
Resultados	/2
Fotos de Metodología y Resultados con pie de foto	/1
Observaciones, Discusión y Conclusión	/1
Referencias APA	/1
Ortografía, Redacción y Justificación de Texto	/1
Practica Subida a blog y Enlace de Blog compartido en Eminus	/1
Puntualidad	/1
Total	/10